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技術文章
蛋白質藥品冷凍干燥技術研究進展
1引言
由于凍干藥品呈多孔狀、能長時間穩定貯存、并易重新復水而恢復活性,因此冷凍干燥技術廣泛應用于制備固體蛋白質**、口服速溶**及**包埋劑脂質體等藥品。從國家*數據庫得知,目前國內已有注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長**、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素α2b、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準上市。截止2000年2月,美國FDA已批準的生物技術藥共計76個。
冷凍干燥技術zui早于1813年由英國人Wollaston發明。1909年Shsckell試驗用該方法對抗**、菌種、狂犬病毒及其它生物制品進行凍干保存,取得了較好效果。在**次世界大戰中,對血液制品的大量需求大大刺激了冷凍干燥技術的發展,從此該技術進入了工業應用階段。此后,制冷和真空設備的飛速發展為快速發展冷凍干燥技術提供了強有力的物質條件。進入上個世紀的九十年代,科學技術的迅猛發展和人民群眾對健康保障的需求為藥品冷凍干燥技術的飛速發展提供了強大的動力,在藥品凍干損傷和保護機理、藥品凍干工藝、藥品冷凍干燥機等方面取得了巨大的成績。但藥品冷凍干燥技術是一門邊緣學科,需要生物學、藥學、制冷、真空和控制等知識的交叉和綜合,因此仍存在亟待解決的問題。
2藥品冷凍干燥原理及特點
藥品冷凍干燥是指把藥品溶液在低溫下凍結,然后在真空條件下升華干燥,除去冰晶,待升華結束后再進行解吸干燥,除去部分結合水的干燥方法。該過程主要可分為:藥品準備、預凍、一次干燥(升華干燥)和二次干燥(解吸干燥)、密封保存等五個步驟。藥品按上述方法凍干后,可在室溫下避光長期貯存,需要使用時,加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液,即可恢復到凍干前的狀態。與其它干燥方法相比,藥品冷凍干燥法具有非常突出的優點和特點:
a)藥液在凍結前分裝,劑量準確;
b)在低溫下干燥,能使被 干燥藥品中的熱敏物質保留下來;
c)在低壓下干燥,被 干燥藥品不易氧化變質,同時能因缺氧而**或抑制某些**的活力;
d)凍結時被 干燥藥品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔結構而且顏色基本不變;
e)復水性好,凍干藥品可迅速吸水還原成凍干前的狀態;
f)脫水徹底,適合長途運輸和長期保存。
雖然藥品冷凍干燥具有上述優點,但是干燥速率低、干燥時間長、干燥過程能耗高和干燥設備投資大等仍是該技術的突出缺點。
3藥品凍干損傷和保護機理
藥品冷凍干燥是一個多步驟過程,會產生多種應力使藥品變性,如低溫應力、凍結應力和干燥應力。其中凍結應力又可分為枝狀冰晶的形成,離子濃度的增加,PH值的改變和相分離等情況。
因此,為了保護藥品的活性,通常在藥品配方中添加活性物質的保護劑。它需要具備四個特性:玻璃化轉變溫度高、吸水性差、結晶率低和不含還原基。
常用的保護劑有如下幾類物質:
a)糖類/多元醇:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等;
b)聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等;
c)無水溶劑:乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等;
d)表面活性劑:Tween 80等;
e)氨基酸:L-絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等;
f)鹽和胺:磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等;
由于冷凍干燥過程存在多種應力損傷,因此保護劑保護藥品活性的機理也是不同的,可以分為低溫保護和凍干保護。
對于低溫保護,目前被廣為接受的液體狀態下蛋白質穩定的機理之一是優先作用原理。優先作用是指蛋白質優先與水或水溶液中的保護劑作用。在有起穩定作用的保護劑存在的條件下,蛋白質優先與水作用(優先水合),而保護劑優先被排斥在蛋白質區域外(優先排斥)。在這種情況下,蛋白質表面就比其內部有較多的水分子和較少的保護劑分子。優先作用原理同樣適用于冷凍-融解過程。蛋白質保護劑,在溶液中被從蛋白質表面排斥,在凍結過程中能夠穩定蛋白質。但是優先作用機理不能完全解釋用聚合物或蛋白質自身在高濃度時保護蛋白質的現象。
在凍干過程中,由于蛋白質的水合層被除去,優先作用機理不再適用。對于凍干保護機理,仍在研究探討之中,目前主要有兩種:
a)水替代假說。許多研究者認為由于蛋白質分子中存在大量氫鍵,結合水通過氫鍵與蛋白質分子聯結。當蛋白質在冷凍干燥過程中失去水分后,保護劑的羥基能替代蛋白質表面的水的羥基,使蛋白質表面形成一層假定的水化膜,這樣可保護氫鍵的聯結位置不直接暴露在周圍環境中,穩定蛋白質的結構,防止蛋白質因凍干而變性,使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下,仍保持蛋白質結構與功能的完整性。
b)玻璃態假說。研究者認為在含保護劑溶液的干燥過程中,當濃度足夠大且保護劑的結晶不會發生時,保護劑-水混合物就會玻璃化。研究發現在玻璃態下,物質兼有固體和流體的行為,粘度極高,不容易形成結晶,且分子擴散系數很低,因而具有粘性的保護劑包圍在蛋白質分子的周圍,形成一種在結構上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體,使大分子物質的鏈鍛運動受阻,阻止蛋白質的伸展和沉淀,維持蛋白質分子三維結構的穩定,從而起到保護作用。
目前大部分學者贊同"水替代假說",因為可以通過實驗檢測到蛋白質和保護劑之間的氫鍵,為理論提供證據。事實上,無論是"水替代假說"還是"玻璃態假說",它們的基礎都是基于藥液實現了部分或全部玻璃化凍結。
4凍干工藝及優化
由于藥品冷凍干燥過程會產生多種應力,對凍干藥品的藥性有很大的影響,因此對藥品冷凍干燥過程進行合理設計,對于減少凍干損傷和提高凍干藥品的質量有重大的意義。
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